mRNA表达量(RT-PCR)

实时荧光定量PCR技术(Real-time Quantitative PCR,qPCR)是指在PCR反应体系中加入可与DNA产物特异性结合的荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最终通过相对定量或绝对定量的方法确定各个样本的本底表达量。qPCR所使用的荧光化学试剂可分为两种:荧光染料和荧光探针。

荧光染料SYBR Green:嵌入到双链DNA分子后构象发生变化,能够吸收497nm的激发光并发出520nm的荧光;而不掺入DNA双链中的染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

 

 

TaqMan 荧光探针法qPCR 检测原理图

TaqMan 荧光探针:扩增时加入一个特异性的寡核苷酸荧光探针,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq 酶的 5'-3' 外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

SYBR Green 荧光染料法qPCR检测原理图

 

方法

 

 

优点

 

 

缺点

 

 

应用

 

SYBR GREEN 法

 

 

方便快捷,不必针对各个基因设计合成TaqMan探针,具有价格优势。

 

 

无模板特异性,对引物特异性要求较高,需进行熔解曲线分析;灵敏度相对较低。

 

 

应用于基因的差异表达分析,比如RNA干扰效果确认。

 

 

TaqMan 探针法

 

 

荧光化合物标记到特异性的寡核苷酸上,具有高度特异性,重复性好,荧光信号强。

 

 

只适合一个特定的目标,探针价格较高。

 

 

通常应用于基因拷贝数的确定,在临床诊断中最常用,比如病毒和病原菌定量检测。

 

 

 

SYBR GREEN 法和 TaqMan 探针法的区别

服务流程

1)样本抽提及反转录—相对定量Q-PCR—引物设计合成—PCR反应条件优化—上机检测及数据分析

2)样本抽提及反转录—绝对定量Q-PCR—引物设计合成—标准品制备—PCR反应条件优化—上机检测及数据分析

 

定量方法

 

 

原理

 

 

技术应用

 

绝对定量(Absolute Quantification,AQ)

 

 

是测定目的基因在样本中的分子数目,即通常所说的拷贝数。

 

 

是测定目的基因在样本中的分子数目,即通常所说的拷贝数。

 

 

相对定量

(Relative Quantification,RQ)

 

 

测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例,而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。

 

 

基因在不同组织中的表达差异;药物疗效考核;耐药性研究。

 

 

 

技术应用

RNA研究