mRNA表达量（qPCR）-导科医药技术(上海)有限公司

mRNA表达量（RT-PCR）

实时荧光定量PCR技术（Real-time Quantitative PCR，qPCR）是指在PCR反应体系中加入可与DNA产物特异性结合的荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最终通过相对定量或绝对定量的方法确定各个样本的本底表达量。qPCR所使用的荧光化学试剂可分为两种：荧光染料和荧光探针。

荧光染料SYBR Green：嵌入到双链DNA分子后构象发生变化，能够吸收497nm的激发光并发出520nm的荧光；而不掺入DNA双链中的染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

TaqMan 荧光探针法qPCR 检测原理图

TaqMan 荧光探针：扩增时加入一个特异性的寡核苷酸荧光探针，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq 酶的 5'-3' 外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

SYBR Green 荧光染料法qPCR检测原理图

方法

优点

缺点

应用

SYBR GREEN 法

方便快捷，不必针对各个基因设计合成TaqMan探针，具有价格优势。

无模板特异性，对引物特异性要求较高，需进行熔解曲线分析；灵敏度相对较低。

应用于基因的差异表达分析，比如RNA干扰效果确认。

TaqMan 探针法

荧光化合物标记到特异性的寡核苷酸上，具有高度特异性，重复性好，荧光信号强。

只适合一个特定的目标，探针价格较高。

通常应用于基因拷贝数的确定，在临床诊断中最常用，比如病毒和病原菌定量检测。

SYBR GREEN 法和 TaqMan 探针法的区别

服务流程

1）样本抽提及反转录—相对定量Q-PCR—引物设计合成—PCR反应条件优化—上机检测及数据分析

2）样本抽提及反转录—绝对定量Q-PCR—引物设计合成—标准品制备—PCR反应条件优化—上机检测及数据分析

定量方法

原理

技术应用

绝对定量(Absolute Quantification，AQ)

是测定目的基因在样本中的分子数目，即通常所说的拷贝数。

相对定量

(Relative Quantification，RQ)

测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例，而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。

基因在不同组织中的表达差异；药物疗效考核；耐药性研究。

技术应用

RNA研究